Padronização e validação do método de vírus, neutralização para quantificação de anticorpos contra febre aftosa

Abstract

A febre aftosa (FA) é uma doença causada por vírus do gênero Aphtovirus, pertencente à família Picornaviridae. A vacinação sistemática vem sendo empregada como recurso profilático central dos programas de erradicação da doença. O teste de vírus neutralização (VNT) é uma alternativa para avaliar a potência de vacinas, visto que a proteção à FA está associada à indução de altos níveis séricos de anticorpos neutralizantes. O objetivo deste trabalho foi padronizar e validar o método de VNT, incluindo uma etapa colorimétrica na interpretação dos resultados. Na padronização do método foram utilizados soros de animais vacinados, sorotipos virais O1 Campos, A24 Cruzeiro e C3 Indaial, os quais foram analisados previamente pelo Instituto Pirbright (Inglaterra). Foram utilizadas as linhagens celulares BHK-21 e IB-RS-2. Os soros foram diluídos em microplacas e em seguida 100 TCID50 de suspensão viral foram adicionados a cada cavidade. As placas foram incubadas a 37ºC em estufa com 5% de CO2 durante uma hora e, em seguida, foi adicionada a suspensão celular na concentração de 106 células/mL. As microplacas foram incubadas durante 48 horas. Os títulos foram calculados conforme Spearman & Kärber e expressos em log (TCID50/mL). A média do título (n=18) obtida para o sorotipo A24 Cruzeiro em BHK-21 foi de 5,27 ± 0,52, enquanto a média (n=18) para IB-RS-2 foi de 7,43 ± 0,30. As leituras do sorotipo A24 Cruzeiro em IB-RS-2 foram: 7,26; 7,20 e 7,43 (TCID50/mL), para leitura em microscópio óptico sem coloração, corada com azul de metileno e com vermelho neutro, respectivamente. O coeficiente de correlação de Pearson entre os resultados do VNT padronizado por esse estudo e os resultados do Instituto Pirbright foi de 0,96 para o sorotipo O1 Campos, 0,96 para A24 Cruzeiro e 0,95 para C3 Indaial. Após a padronização, o método foi validado com a determinação dos parâmetros de precisão, exatidão, estabilidade, linearidade e robustez. O teste de vírus neutralização em células IB-RS-2, com etapa de coloração com vermelho neutro e leitura em leitor de microplacas foi aprovado quanto à precisão, exatidão, estabilidade, linearidade e robustez do método. Conclui-se que o método validado atende às exigências das aplicações analíticas de modo a assegurar a confiabilidade dos resultados, sendo adequado para quantificação de anticorpos neutralizantes e, portanto, podendo ser utilizado para a avaliação da potência de vacinas contra febre aftosa. Suporte: o projeto foi financiado pela Vallée S/A.