Avaliação da reação em cadeia pela polimerase (PCR) utilizando diferentes protocolos de extração de DNA para diagnóstico da brucelose canina

Abstract

A brucelose canina é uma doença zoonótica causada pela Brucella canis, que afeta principalmente o sistema reprodutor dos cães com os sinais clínicos de abortamento, infertilidade, falhas de concepção, orquite e epididimite. A importância da enfermidade está relacionada com seus altos índices de ocorrência em cães comerciais e o consequente impacto econômico. O diagnóstico laboratorial pode ser realizado por meio de exames sorológicos, mas o teste de eleição é a hemocultura, devido ao longo período de bacteremia e à baixa sensibilidade dos testes sorológicos empregados para detecção de anticorpos. As técnicas de amplificação dos ácidos nucléicos possibilitam um diagnóstico rápido e com altos valores de sensibilidade. O trabalho investigou a aplicação da reação em cadeia pela polimerase (PCR) para o diagnóstico da brucelose canina em amostras de DNA obtidas de sangue canino por três métodos de extração e purificação e comparou seu desempenho com a hemocultura. Foram coletadas amostras de sangue de 24 cães da raça Pug com histórico de problemas reprodutivos, provenientes de um canil comercial localizado em um município do Estado de São Paulo, Brasil. Ademais, foram coletadas amostras de sangue total de 21 cães sem sinais clínicos sugestivos de brucelose canina. A estirpe de referência de Brucella canis (RM6/66) foi utilizada como controle positivo nos procedimentos para comparação dos protocolos de extração. As amostras de sangue foram submetidas ao teste de hemocultura, sendo semeadas em Caldo Fosfato Triptose (Difco), com 5% de soro fetal bovino (SFB) e incubadas a 37°C, por 30 dias. O protocolo de extração A foi baseado na lise enzimática e na purificação com solventes orgânicos; os protocolos B e C foram baseados na lise enzimática e na purificação em coluna de sílica, utilizando os protocolos para extração de DNA de tecidos e sangue total, respectivamente, preconizados pelo kit DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen). Nos protocolos A e B foi utilizado o sedimento celular sanguíneo obtido pela lavagem de 1 mL de sangue total. No protocolo C um volume de 100 uL de sangue total foi utilizado. Em todos protocolos empregados foi realizado o tratamento das amostras com lisozima e esferas de zircônia. A PCR foi realizada com os primers ITS66 e ITS279, direcionados ao DNA codificador da região interespaçadora 16S-23S do RNA ribossomal. Os três diferentes protocolos de extração e a hemocultura, aplicados em 46 amostras de sangue canino, resultaram em 17 cães positivos pela hemocultura e 15, 13 e 5 cães positivos, respectivamente, pelos protocolos A, B e C. Houve diferença significativa no número de cães positivos detectados pela PCR utilizando diferentes métodos de extração, indicando a necessidade de se interpretar com cautela resultados obtidos em testes de PCR realizados em diferentes laboratórios, uma vez que diferentes protocolos de extração podem influenciar na sensibilidade diagnóstica. Ressalta-se ainda que a garantia da eficiência diagnóstica depende da padronização do método de extração de DNA.