Frequência de subpopulações espermáticas no sêmen ovino criopreservado, identificadas por sondas fluorescentes

Resumo

Vinte amostras de semen criopreservadas, de dez carneiros Santa Ines, foram submetidas a avaliacao multiparametrica com associacao de sondas fluorescentes com o objetivo de verificar a frequencia de subpopulacoes espermaticas (SBP). Foi empregada a associacao das sondas iodeto de propidio (integridade de membrana plasmatica), aglutinina de Pisum sativum conjugada a fluoresceina de isotiocianato - FITC-PSA (integridade acrossomal) e JC-1 (potencial da membrana mitocondrial). Para tanto, uma amostra de 5μL de semen descongelado (2 X 106 espermatozoides) foi diluida em 120μL de meio X-CELL (IMV, L'Aigle, France), ao qual foram adicionadas as solucoes de trabalho das sondas fluorescentes nas seguintes proporcoes: 2μL de IP (25mg/mL) e 2μL de JC-1 (5mg/mL). A mistura foi homogeneizada, mantida protegida da luz e incubada a 37oC por 10 a 15 minutos. Apos esse periodo, foram adicionados 25μL da solucao de trabalho de FITC-PSA, procedendo-se novamente a homogeneizacao e logo em seguida uma aliquota dessa mistura de 10μL foi colocada entre lamina e laminula e 100 espermatozoides foram avaliados sob imersao, aumento de 1000x, em microscopia de epifluorescencia. Com esta tecnica foram identificadas e classificadas as celulas em oito subpopulacoes (SBP) espermaticas como descrito a seguir: SBP 1 - membrana plasmatica integra, acrossomo intacto e alto potencial de membrana mitocondrial; SBP 2 - membrana plasmatica integra, acrossomo intacto e baixo potencial de membrana mitocondrial; SBP 3 - membrana plasmatica integra, acrossomo lesado e alto potencial de membrana mitocondrial; SBP 4 - membrana plasmatica integra, acrossomo lesado e baixo potencial de membrana mitocondrial; SBP 5 - membrana plasmatica lesada, acrossomo intacto e alto potencial de membrana mitocondrial; SBP 6 - membrana plasmatica lesada, acrossomo intacto e baixo potencial de membrana mitocondrial; SBP 7 - membrana plasmatica lesada, acrossomo lesado e alto potencial de membrana mitocondrial; SBP 8 - membrana plasmatica lesada, acrossomo lesado e baixo potencial de membrana mitocondrial. As frequencias obtidas para as diferentes SBP foi de: SBP 1: 17,1%; SBP 2: 18,5%; SBP 3: 0,0%; SBP 4: 0,0%; SBP 5: 15,3%; SBP 6: 22,6%; SBP 7: 09,2% e SBP 8: 17,6%. As SBP 1, 2, 3 e 4 compoem os espermatozoides viaveis e a soma delas representou 35,6% do total, permitindo concluir que apos a criopreservacao apenas um pequeno percentual de celulas esta apta a realizar o processo de fertilizacao.