Caracterização da matriz extracelular intratumoral como potencial indicador prognóstico para mastocitomas cutâneos caninos (projeto em andamento)

Resumo

Introdução: O Mastocitoma, um dos tumores de pele mais comuns em cães, representa cerca de 25% de todas as neoplasias cutâneas malignas nestes animais. A alta frequência em raças originárias dos Bulldogs sugere a existência de uma predisposição hereditária [1,2,3,4]. A avaliação prognóstica em casos de mastocitomas cutâneos caninos é realizada de acordo com a graduação proposta por Patnaik et al. [7] e ainda norteia a conduta da maioria dos médicos veterinários diante dessa neoplasia. No entanto, tal critério de classificação é considerado subjetivo [8], estimulando pesquisas com marcadores prognósticos complementares ou mais objetivos [3]. O microambiente tumoral é formado pela associação de componentes químicos e biológicos, como a vascularização do tecido e a matriz extracelular (MEC). Sabe-se que a interação entre células cancerosas e o microambiente pode promover o crescimento de um tumor e de protegê-lo do ataque imunológico [5]. A MEC é formada por diversas substâncias, como colágeno e elastina, algumas delas podem se ligar a fatores de crescimento durante a proliferação celular tumoral, limitando sua difusão. A angiogênese, também pode ser inibida ou estimulada de acordo com a composição da MEC. Enzimas como as metaloproteinases de matriz facilitam a invasão e, consequentemente, a disseminação e as metástases, por alterarem a estrutura do colágeno intersticial [6]. O presente trabalho foi delineado para investigar a existência de variações dos constituintes da MEC entre os diferentes graus histopatológicos de mastocitomas cutâneos caninos, considerando as duas propostas de graduação mais utilizadas [9,7].

Materiais e métodos: Foram utilizados 73 casos de mastocitomas cutâneos caninos, corados pelas técnicas de Tricrômio de Masson e Picrossírius, para identificação de colágeno e de Verhoeff, para elastina [10]. Das lâminas coradas pelo Tricrômio de Masson foram obtidas imagens de cinco campos intratumorais representativos em cada lâmina, à objetiva de 40x. Observadas em microscópio óptico com câmera digital de alta definição (Leica DM500 e ICCD50 HD) e software para captura de imagens (Leica LAS EZ). A área contendo colágeno em cada campo foi mensurada com a seleção dos tons de azul, utilizando-se o software ImageJ. A média dos cinco campos resultou no índice de colágeno. As lâminas coradas pela técnica de Verhoeff foram analisadas com a mesma metodologia. Para as lâminas coradas pela técnica de Picrossírius, foi utilizado o microscópio com luz polarizada com câmera digital (AxioImager. A2 e Axiocam MRc, Zeiss) e software para captura de imagens (AxioVision, versão 4.9.1, Zeiss). Foram obtidas três imagens intratumorais representativas da lâmina, à objetiva de 20x. Os tipos de colágeno (tipo I, em tons de amarelo-laranja-vermelho, ou III, em verde) estão sendo analisadas com software Image ProPlus (Media Cybernetics). As médias de porcentagem da área ocupadas por tipo de colágeno serão seus respectivos índices de colágeno. Para comparação entre índices de colágeno e elastina de cada amostra e os graus histopatológicos foram utilizados os testes de ANOVA/Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, com nível de significância de 5%, utilizando o software Graphpad Prism.

Resultados e Discussão: Os resultados obtidos com as marcações com Tricrômio de Masson confirmaram a existência diferenças significantes em relação à quantidade de colágeno entre os graus histopatológicos de Patnaik et al. [7] (p=0,0012), principalmente entre os graus II e III (p<0,05) e os graus I e III (p<0,01) (Figura 1). De modo semelhante, quando são comparados aos graus propostos por Kiupel et al. [9], a análise estatística confirma a existência de diferenças extremamente significantes (p<0,0001) quanto à área ocupada por colágeno entre os graus de malignidade do tumor (Figura 2), com menor quantidade de colágeno para os tumores de alto grau em relação aos classificados como de baixo grau. O método de Picrossírius permitiu a visualização das fibras colágenas tipo I, mais espessas e birrefringentes com tonalidades laranja, amarelo e vermelho, bem como as fibras do tipo III, mais delicadas e dispersas, com birrefringência verde. Foi observada a presença de grande quantidade de fibras elásticas na pele normal e em artéria elástica, nos controles utilizados. Entretanto, as mesmas se apresentaram em mínimas proporções em mastocitomas cutâneos caninos. As quantificações destas marcações histoquímicas encontram-se em andamento em nosso laboratório. O colágeno, maior constituinte da MEC na pele íntegra, encontra-se diminuído em mastocitomas, sendo sua quantidade menor quanto maior o grau de malignidade desses tumores. Esta característica havia sido descrita por Patnaik et al. [7], mas não foi confirmada por análises quantitativas e qualitativas. Novas investigações são necessárias para a elucidação dos mecanismos de interação desses componentes. Pulz, 201411 verificou que a expressão de metaloproteinases de matriz e seus inibidores, particularmente a proteína TIMP-1, tem valor prognóstico nesta neoplasia. Sendo assim, a preservação e/ou a síntese de colágeno possuem potencial para se tornarem alvos terapêuticos para mastocitomas. A diferenciação entre os tipos de proteínas presentes na MEC também pode interferir na progressão tumoral, já que as metaloproteinases possuem especificidade por substrato. A elastina está presente em grande quantidade nos tecidos que requerem propriedades físicas de elasticidade como artérias e ligamentos e encontra-se também em menor quantidade na pele (SANTOS et al., 2004). Entretanto, foram encontradas quantidades mínimas de tal substância em fragmentos de pele de cães acometida por mastocitomas. Como controle positivo para a técnica de Verhoeff, foi realizada a coloração de cortes histológicos de artérias, onde é sabida a presença de fibras elásticas. A observação da elastina presente na pele íntegra revela a presença de uma quantidade superior à encontrada nos mastocitomas. Essa redução na proporção de elastina pode também estar relacionada com a progressão tumoral, porém não foi verificada tal associação, pois o processo de quantificação da mesma ainda está em andamento.

Conclusão: Mastocitomas de maior grau histopatológico apresentam menor quantidade de colágeno intratumoral, e a quantificação dessa proteína pode auxiliar na sua classificação.