Diferenciação molecular de espécies de leishmania: resultados preliminares

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B. B. Trigo
S. C. Paulan
F. M. Oliveira
D. K. K. Kubota
P. K. R. K. Ito
C. M. Nunes

Resumo

Mais de vinte espécies de Leishmania causam amplo espectro de manifestações clínicas em animais e humanos, sendo genericamente classificadas em leishmaniose cutânea (LC), mucocutânea (LMC) e visceral (LV), todas com ocorrência no Brasil. O diagnóstico dessa zoonose é estabelecido por avaliação clínica, sorológica e parasitológica (visualização de formas amastigotas), seguida ou não do isolamento em meio de cultura e, mais recentemente, por técnicas moleculares. Atualmente o “padrão ouro” para diferenciação das espécies de Leishmania spp. é a eletroforese de isoenzimas (multilocus enzyme electrophoresis – MLEE), técnica laboriosa, de aplicação restrita a amostras cultivadas e realizada em laboratórios de referência. Entretanto, como as técnicas baseadas na reação em cadeia pela polimerase (PCR) têm sido amplamente aplicadas para a caracterização e diferenciação das espécies de Leishmania, elas passaram a ser um importante recurso para estudos epidemiológicos e para a priorização de medidas de controle dessa zoonose. Este trabalho propõe a validação, por PCR em Tempo Real (qPCR), de oligonucleotídeos iniciadores (primers) previamente validados in silico por PCR eletrônico. Adicionalmente, alguns dos primers já validados e descritos como espécie-específicos também foram incluídos nesta validação por qPCR. Os primers foram testados em estirpes de referência de Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. infantum e L. major, cedidas pela coleção de Leishmania, do Instituto Oswaldo Cruz, e de L. chagasi, estirpe isolada localmente e cedida pelo Laboratório de Imunologia da FMVA da Unesp. De 186 pares de primers validados in silico, foram inicialmente escolhidos e testados cinco pares para cada espécie: um para L. amazonensis; um para L. infantum; dois para L. braziliensis; e dois para L. major. Os resultados obtidos confirmam a especificidade do par de primers para L. amazonensis. Os demais pares não apresentaram resultados satisfatórios, tanto relacionados à não amplificação de fragmento de DNA, como à inespecificidade. Tais fatos podem estar relacionados a fatores como: variação entre as estirpes, formação de dímeros, presença de regiões repetitivas do genoma, dentre outros, uma vez que a análise in silico realizou seleção randômica e ampla para potenciais primers num conjunto de dados específico. Outros primers deverão ser testados até que se obtenha um conjunto de pares espécie-específicos adequado para a composição de uma plataforma que permita estabelecer o diagnóstico diferencial das leishmanioses.

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Como Citar
TRIGO, B. B.; PAULAN, S. C.; OLIVEIRA, F. M.; KUBOTA, D. K. K.; ITO, P. K. R. K.; NUNES, C. M. Diferenciação molecular de espécies de leishmania: resultados preliminares. Revista de Educação Continuada em Medicina Veterinária e Zootecnia do CRMV-SP, v. 16, n. 3, p. 72-72, 11 dez. 2018.
Seção
VIII SIMPÓSIO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL