Modulação da comunicação intercelular via junções do tipo gap nas células estreladas hepáticas em modelos 3D da doença hepática gordurosa não alcoólica (projeto)

Abstract

Introdução: a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) está relacionada à obesidade e pode evoluir de esteatose para esteatohepatite (ENA), fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular. A esteatose é considerada como um importante fator de risco na progressão da fibrose, principalmente pela secreção de citocinas e fatores de crescimento pelos hepatócitos gordurosos. A liberação parácrina dessas substâncias favorece a ativação e proliferação das células estreladas (CEHs), principais células envolvidas na fibrogênese hepática. Diversas drogas e tratamentos experimentais vêm sendo desenvolvidos para modular a atividade funcional das CHEs, sendo a comunicação intercelular via junções GAP um importante alvo terapêutico. A comunicação intercelular das células estreladas é realizada via junções do tipo GAP, mediadas pela conexina 43 (Cx43), possibilitando o livre trânsito de pequenas moléculas, metabólitos e mensageiros secundários, com papel importante na regulação da função e homeostasia celular. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares associados à inibição desses canais e redução da expressão de Cx43 nas CHEs ainda não são conhecidos. Modelos in vitro que utilizam o cocultivo de hepatócitos e CEHs podem simular alguns aspectos fisiopatogênicos da DHGNA, reduzindo o uso de animais de experimentação nos testes pré-clínicos e acelerando o processo de descoberta de novas moléculas. O modelo de cocultivo 3D em esferoides foi recentemente padronizado pelo grupo e mimetiza o microambiente encontrado no fígado, permitindo a interação de diferentes células e seus subprodutos.

Objetivos: avaliar a participação da comunicação intercelular via junções do tipo GAP na funcionalidade das CHEs e, consequentemente, sua potencialidade como alvo terapêutico em um modelo 3D da DHGNA.

Métodos: o modelo 3D será obtido pelo cocultivo de linhagens de hepatócitos C3A e CHEs LX2 humanas (48h, MEM 10% SFB). Os grupos analisados compõem esferoides formados com hepatócitos normais ou induzidos à esteatose pela incubação com ácidos graxos livres. As CHEs serão tratadas com siRNA para Cx43 ou inibidores farmacológicos das junções GAP (carbenoxolona e Gap27), antes da formação dos esferoides. Esses cocultivos 3D serão submetidos à avaliação funcional da comunicação intercelular, para garantir a efetividade da inibição das junções GAP, sendo depois avaliados por citometria de fluxo para análise do ciclo celular, proliferação e apoptose. Adicionalmente, serão avaliadas as conexinas 43, 26 e 32 pelas técnicas de imunofluorescência, western blot e PCR em tempo real.