Diagnóstico molecular de Giardia duodenalis pela amplificação dos genes GDH e SSU-rDNA

Abstract

Giardia duodenalis é um dos mais prevalentes protozoários intestinais de humanos, mamíferos domésticos e silvestres, sendo também o de maior em caninos domésticos na cidade de Botucatu (SP). A giardíase canina é amplamente encontrada na clínica médica de pequenos animais e o número de casos suspeitos da doença vem crescendo significativamente. A infecção por esse parasita ocorre facilmente entre filhotes agudamente infectados e entre adultos cronicamente infectados. A giardíase pode causar sintomas clínicos graves, particularmente em crianças, idosos e pacientes mal nutridos e/ou imunocomprometidos. O presente trabalho tem como objetivo avaliar a eficiência do diagnóstico molecular de G. duodenalis por meio da amplificação dos genes glutamate dehydrogenase (GDH) e small subunit rDNA (SSU-rDNA) pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). O experimento foi conduzido em conjunto no Laboratório de Enfermidades Parasitárias dos Animais da FMVZ-Unesp, campus de Botucatu, e no Laboratório de Diagnóstico Molecular do Departamento de Microbiologia e Imunologia, IBB-Unesp, campus de Botucatu. Foram utilizadas 80 amostras fecais de cães coletadas no canil do centro de controle de zoonoses de Botucatu (SP). Primeiramente, 1-2 g de fezes frescas foram separados de cada amostra e analisados por microscopia óptica usando a técnica de Faust e colaboradores. Posteriormente, foram pesados em balança de precisão 180-220 mg de fezes e colocados em duplicata em microtubos de 2 ml, sendo mantidos a -20ºC até a extração de DNA. A extração de DNA foi realizada usando kits comerciais para extração de DNA de amostras fecais (QIAGEN®). Para o diagnóstico molecular, aproximadamente 415 e 170 pares de base de uma região dos genes GDH e SSU-rDNA foram amplificados por meio de um protocolo baseado numa reação de semi-nested e Nested-PCR, respectivamente. Os produtos das reações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% em TBE e revelados com brometo de etídio (0.5 mg/ml). Os fragmentos de DNA foram analisados comparativamente com marcadores de DNA de 100 pares de base e fotografados em analisador de imagem. A técnica de microscopia óptica foi capaz de detectar cistos de G. duodenalis em 25% (20/80) das amostras analisadas. O método da PCR demonstrou alta sensibilidade diagnóstica, sendo capaz de detectar o DNA do microrganismo em todas as amostras positivas na microscopia óptica. O diagnóstico molecular de G. duodenalis mostrou-se uma ferramenta altamente sensível e específica para a detecção do DNA do micro-organismo por meio da amplificação de ambos os genes.