Zinco previne comportamento doentio induzido pelo lipopolissacarídeo após desafio estressor em ratos

Abstract

Introdução: O comportamento doentio (CD) é uma resposta comportamental e imune, específica e temporária, que ocorre em diversas espécies em diferentes processos inflamatórios/infecciosos [1-4]. É geralmente acompanhado por febre, prostração, diminuição da atividade exploratória, do comportamento social, alimentar e sexual, além de prejuízos cognitivos [1,5]. As alterações do CD são consideradas como estratégias orquestradas pelo hospedeiro para melhor lidar contra microorganismos invasores, cura rápida e redução da exposição do doente a predadores e contaminação de sua colônia [2,4]. Porém, o CD é considerado um estado motivacional modulado pelo contexto ambiental [6]. Por exemplo, se o animal estiver correndo risco de morte, ou engajado em lutas hierárquicas, o CD normalmente é momentaneamente interrompido para priorizar os comportamentos de luta ou fuga [6,7]. O lipopolissacarídeo (LPS) mimetiza infecções por bactérias Gram-negativas com a liberação de citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral (TNF) -α e interleucinas -1β e -6 [8,9], e ativação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) [10], sendo considerado um potente indutor de CD [11]. O zinco regula os sistemas imune e nervoso, sendo, inclusive, prescrito para o tratamento de gripe, infecções respiratórias e pneumonia [12- 14], embora sem preocupações com intercorrências estressoras. Considerando que o CD pode ser expresso de maneira diferente em situações estressoras, no presente trabalho o CD foi induzido em ratos com administração de LPS e subsequentemente os animais foram expostos ao desafio estressor por contenção. O objetivo do trabalho foi verificar os efeitos do tratamento com zinco no CD de ratos estressados.

Material e Métodos: Foram utilizados quarenta ratos Wistar machos adul tos (FMVZ-USP, Protocolo n°3130/2013) separados em quatro grupos (n = 10): (1) SAL+SAL, salina estéril (0,2 ml/100 g, i.p.) e uma hora depois outra dose de salina s.c. na nuca. (2) LPS+SAL, LPS (0127:B8, 100 μg/kg, i.p.) e uma hora depois salina (0,2 ml/100 g, s.c.). (3) LPS+Zn, LPS (100 μg/kg, i.p.) e uma hora depois sulfato de zinco (ZnSO4, 2 mg/kg, s.c.). (4) SAL+Zn, salina (0,2 ml/100 g, i.p.) e uma hora depois zinco (2 mg/kg, s.c.). Após uma hora da segunda injeção, cada rato foi colocado em tubo de contenção para uma sessão de duas horas. Nos cinco minutos finais da contenção, cada rato foi observado para vocalizações ultrassônicas em frequência de 22-kHz (Ultravox, Noldus). Parâmetros avaliados por cinco minutos: número de vocalizações, e tempo total, máximo, médio e mínimo de vocalizações e de silêncio (em secs). Após o teste de vocalização os ratos foram inseridos em arena de campo aberto. Parâmetros avaliados por cinco minutos (Ethovision, Noldus): distância percorrida (cm), velocidade média (cm/s), frequência de levantar, auto-limpeza (secs), e tempo (secs) nas zonas central e periféricas. Após o teste, o plasma foi obtido e utilizado para avaliar níveis de TNF-α, corticosterona, e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), usando-se kits de ELISA. Os dados foram analisados por ANOVA e pós-teste de Tukey. Os resultados são expressos em média ± EP. Os resultados foram considerados significantes para p < 0,05.

Resultados: Após o desafio estressor, o número de vocalizações de 22-kHz (Figura 1) dos ratos foi diminuído pelo LPS (grupo LPS+SAL), comparado ao grupo controle (SAL+SAL). O tratamento com zinco após LPS (LPS+Zn) preveniu a redução nas vocalizações, retornando aos valores do grupo controle. O zinco sem o LPS (SAL+Zn) aumentou o número de vocalizações comparado aos valores dos três grupos. Os outros parâmetros de vocalizações ultrassônicas foram estatisticamente os mesmos entre os três grupos (dados não apresentados). Após o desafio estressor, à distância percorrida e a velocidade média (Figura 2) dos ratos foram diminuídas pelo LPS (grupo LPS+SAL), comparado ao grupo controle (SAL+SAL). O tratamento com zinco após LPS (LPS+Zn) preveniu essa redução, retornando aos valores do grupo controle. O zinco sem o LPS (SAL+Zn) aumentou a distância percorrida e a velocidade média comparadas aos valores dos três grupos. A frequência de levantar (Figura 2) dos ratos foi diminuída pelo LPS (grupo LPS+SAL), comparado ao grupo controle (SAL+SAL). O tratamento com zinco após LPS (LPS+Zn) preveniu essa redução, retornando aos valores do grupo controle. O zinco sem o LPS (SAL+Zn) não alterou o levantar comparando com os grupos SAL+SAL e LPS+Zn. A auto-limpeza (Figura 2) dos ratos foi diminuída pelo LPS (grupo LPS+SAL), comparado ao grupo controle (SAL+SAL). O tratamento com zinco com ou sem LPS (LPS+Zn e SAL+Zn) não impediu a redução da limpeza, resultando em resultados similares aqueles do grupo LPS+SAL. O tempo na zona central (Figura 2) dos ratos foi diminuído pelo zinco (LPS+Zn e SAL+Zn), comparado ao grupo LPS+SAL, mas não sem alterações para LPS+Zn e SAL+Zn versus SAL+SAL. Não foram verificadas diferenças para o tempo na zona periférica entre todos os grupos (Figura 2). Após o desafio estressor, os níveis de TNF-α (Figura 3) dos ratos foram aumentados pelo LPS (grupo LPS+SAL), comparado ao grupo controle (SAL+SAL). Como esperado, não foram detectados níveis de TNF-α nos animais não tratados com LPS (SAL+SAL e SAL+Zn). Interessantemente, o tratamento com zinco após LPS (LPS+Zn) preveniu a liberação de TNF-α no plasma, retornando aos mesmos valores que o grupo controle. Não foram verificadas diferenças para os níveis de corticosterona entre todos os grupos (Figura 3). Portanto, o eixo hipotálamo-pituitária- adrenal (HPA) parece não ter sido afetado pelos tratamentos.Após o desafio estressor, os níveis de BDNF maduro (Figura 4) dos ratos foram aumentados somente pelo zinco (grupo SAL+Zn), comparado aos dados dos outros três grupos. Os níveis de BDNF total (Figura 4) dos ratos foram diminuídos pelo LPS (grupos LPS+SAL e LPS+Zn), comparado aos dados do grupo controle; o zinco sem o LPS (SAL+Zn) resultou em valores semelhantes aqueles do grupo controle.

Conclusões: A administração de LPS induziu o CD em ratos mesmo após desafio estressor, verificado pela diminuição da atividade geral, da comunicação e do aumento nos níveis plasmáticos de TNF-α. O CD é considerado uma estratégia comportamental benéfica para melhor lidar com processos inflamatórios/infecciosos. Porém, em situações perigosas e estressantes o CD deve ser momentaneamente interrompido, para priorizar comportamentos ligados à sobrevivência, como a luta ou fuga. O tratamento com zinco foi capaz de prevenir o CD nos animais expostos ao LPS após o desafio estressor. Portanto, o tratamento com zinco foi benéfico para o animal doente melhorar sua resposta em situações de risco.