Expressão imuno-histoquímica do fator de pluripotência oct-4 em mastocitomas cutâneos caninos

Abstract

Introdução: Os mastocitomas caninos são neoplasias de grande importância para a clínica veterinária, tendo em vista a sua grande incidência na espécie, representando cerca de 20% dos tumores cutâneos caninos e até 30% dos casos malignos [1,2]. Para avaliação do grau de diferenciação celular e consequente malignidade do tumor, tem sido utilizado o grau histopatológico apresentando grandes diferenças de resultados entre patologistas devido a sua característica subjetiva [3]. Atualmente têm sido demonstrada a importância do emprego de instrumentos de prognósticas no tratamento das neoplasias. O Oct-4 está localizado no POU (Pit, Oct e Unc) é altamente expresso em células pluripotentes, sendo considerado como marcador de células-tronco. Está relacionado ao o grau de diferenciação celular em tumores de próstata em humanos4. Wen, et al 2013 relataram a existência de relação com tumores resistentes à quimioterapia e que o Oct-4 estava relacionado com quimioresistência. Já Saisuga et al, 2009 mostraram que a presença do Oct-4 estava relacionada com prognóstico pós-cirúrgico. A avaliação da presença de Oct-4 em células de mastocitomas caninos pode estar relacionada ao grau de malignidade do tumor, ou mesmo ser um fator prognóstico independente, o que auxiliaria no tratamento da neoplasia. Portanto, o presente trabalho foi delineado para caracterizar a expressão de Oct-4 em células cancerosas de mastocitomas caninos, empregando a técnica de imuno-histoquímica e relacionando os resultados obtidos com a graduação histopatológica do tumor.

Materiais e Métodos: As amostras dos tumores, fixadas em formol a 10% e emblocadas em parafina, foram cortadas ao micrótomo, desparafinizadas em estufa e banhos de xilol. A re-hidratação foi realizada por banhos em álcool seriado e banho em água destilada. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com a solução de peróxido de hidrogênio diluído em álcool metílico à 3%, seguido de lavagem em PBS + tween. A recuperação dos antígenos foi efetuada com solução citrato pH 6,0 e aquecida em panela a vapor e em seguida foi realizada a lavagem em PBS. O bloqueio de antígenos inespecíficos foi efetuado com a solução de bloqueio Dako (Protein Block Serum-Free Readyto- use). A incubação com anticorpo primário (Oct-3/4, na diluição de 1:50) foi realizada de acordo com orientações do fabricante. As amostras de controle negativo receberam IgG de camundongo, ao invés do anticorpo primário. Para incubação de anticorpo secundário foi utilizado o kit Dako (Advanced HRP, DakoCytomation) segundo as orientações do fabricante, seguido da aplicação do cromógeno DAB. A contracoloração foi realizada com Hematoxilina de Harris. Os tumores foram analisados de modo a ser caracterizado o padrão de marcação predominante, se nuclear e/ou citoplasmática, ou negativo para Oct-4. A análise estatística foi realizada agrupando-se os casos de duas maneiras: (1) considerando somente a marcação nuclear como positiva, e (2) considerando ambas as marcações, citoplasmática e nuclear, como positivas. Para comparar as marcações entre os graus de Kiupel et. al, 2011, foi utilizado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney.

Resultados: Foram avaliadas 30 amostras de diferentes mastocitomas cutâneos caninos provenientes dos arquivos histopatológicos de hospitais veterinários colaboradores (FMVZ-USP, Universidade Anhembi-Morumbi e FZEA-USP). Houve grande diversidade nos resultados encontrados para marcação imuno-histoquímica de Oct-4. Dos 30 casos analisados, 13 amostras apresentaram marcação citoplasmática com alguns núcleos marcados (Figura 1A); quatro tiveram apenas marcação nuclear, sem marcação citoplasmática evidente (Figura 1B); sete amostras apresentaram apenas marcação citoplasmática, sem marcação nuclear evidente (Figura 1C); seis foram negativas e não tiveram marcação alguma (Figura 1D). O controle negativo não apresentou nenhum tipo de marcação, como pode ser visto na Figura 1E. Outro resultado interessante foi que algumas células da camada basal da epiderme, localização sabidamente comum para células-tronco [8], apresentaram marcação especificamente nuclear, como pode ser visto na figura 1F. Quando analisados pela classificação de Patnaik et al, 19849 o número de tumores de grau I disponíveis para análise estatística foi muito reduzido (n=2), o que inviabilizou a realização da análise de variância. Mesmo assim, a comparação entre os graus II e III de [9] por meio de Teste t não revelou diferenças significantes (p>0,05). Na análise com base na classificação de Kiupel et al 20117, também não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes, tanto quando considerada apenas a marcação nuclear como positiva (p=0,4731), quanto quando foram consideradas positivas as marcações nuclear e citoplasmática (p=0,6283).

Conclusão: Não foram constatadas diferenças na imunomarcação para Oct-4 entre os graus histopatológicos, para ambos os métodos de graduação. Porém, a presente análise deverá ser ampliada no futuro, principalmente para aumentar o número de casos de grau I. Foi obtida marcação considerada específica e satisfatória, com lâminas de controle negativo satisfatórias. Futuramente, torna-se necessária a avaliação de um maior número de casos, preferencialmente utilizando-se anticorpos específicos para Oct-4 e/ou para cada uma de suas isoformas, de modo a individualizá-las e eliminar a marcação concomitante de Oct-3.