Detecção de estirpes virulentas de Arcobacter butzleri em carnes de frangos e suínos provenientes de açougues no município de São Paulo (projeto em andamento)

Abstract

Introdução: Arcobacter spp. são bactérias Gram negativas pertencentes à família Campylobacteraceae que possuem características distintas em sua forma de multiplicação, uma vez que apresentam temperatura de crescimento ótima a 30°C de 24h às 48h em microaerofilia ou aerobiose [1]. Até o presente momento, foram descritas dezessete espécies de Arcobacter isoladas de diferentes origens, contudo apenas as espécies A. butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowii são consideradas zoonoses, representando um grupo de agentes patogênicos causadores de toxi-infecções alimentares em seres humanos [2]. A presença deste patógeno em produtos de origem animal representa um risco à saúde dos consumidores, sendo uma preocupação para o setor de produção. Apesar dos mecanismos de patogenicidade do Arcobacter spp. e de seus fatores de virulência serem pouco conhecidos, alguns autores consideram como importantes a produção de alfa hemolisinas [3], a produção de toxinas e a capacidade de invasão em culturas celulares HEP-2 [4, 5, 6]. Atualmente o Brasil é o maior exportador mundial de carne de frango [7] e quarto produtor e exportador de carne suína [8]. Para manter a taxa de crescimento e valorização, os setores de produção devem estar atentos ao aumento das exigências dos consumidores externos, em vários quesitos, dentre os quais se destacam a qualidade sanitária dos plantéis e a segurança dos alimentos de origem animal [9, 10]. O presente foi delineado para investigar a presença de bactérias do gênero Arcobacter em recortes de carnes de aves e suínos comercializadas no Município de São Paulo; bem como de identificar a espécie A. butzleri e determinar a presença de fatores de virulência nas estirpes isoladas, com o emprego da reação em cadeia pela polimerase.

Material e métodos: Foram coletados 300 cortes de peito, asa, coxa e sobrecoxa de carne de frango e 300 de costela, lombo, bisteca e pernil de carne de suínos procedentes de mercados municipais e açougues de São Paulo. As amostras foram transportadas até o laboratório sob-refrigeração e processados no mesmo dia da coleta. Para controle de qualidade dos meios e da reação em cadeia pela polimerase foram utilizadas estirpes de referência A. butzleri ATCC 49616, A. cryaerophilus ATCC 43158 e A. skirrowii ATCC 51132. Os cortes foram pesados e amostras de 25g de carne foram acondicionadas em bolsas esterilizadas contendo 225 mL de água peptonada tamponada que foram posteriormente homogenizadas por 1min em stomacher. Uma alíquota de 1 mL da água peptonada foi semeada em 9 mL no caldo de enriquecimento seletivo descrito por [11] e os tubos foram incubados em aerobiose por 48h a 30°C. Após o período de incubação uma alíquota de 10μL do caldo foi depositada sobre uma membrana estéril de celulose (0,45μm) colocada na superfície do ágar seletivo JM. Após uma hora, o filtro foi retirado e a placa de ágar foi estriada e incubada por 48 a 72h a 30°C. Colônias pequenas, típicas, não hemolíticas foram submetidas à coloração de Gram e à identificação com a reação em cadeia pela polimerase (PCR) e estocadas a -80°C. Os primers descritos por [12] foram utilizados para a caracterização do Arcobacter spp. e do A. butzleri. A PCR foi realizada utilizando-se 5 μL do DNA bacteriano, 1.5 mM de MgCl2, 10 pmoles de cada primer, 1.0 U de Taq DNA polimerase, 1 X tampão de PCR e água até o volume final de 50 μL. A reação foi submetida à desnaturação à 94o C por quatro minutos seguido por 35 ciclos de um minuto à 94oC, um minuto à 55oC e um minuto à 72oC. Foi realizada a pesquisa de nove genes de virulência, com a utilização dos pares de primers descritos por [13]: ciaB, cj1349, cadF, irgA, hecA, hecB, mviN, pldA e tlyA.

Resultados: Até o momento, foram examinados 115/300 cortes de carne de suínos e 105/300 de carne de frangos, a presença de Arcobacter spp. foi confirmada em 10,4% (12/115) de amostras de carne de suínos e 4,7% (5/105) de carne de aves. Desta triagem foram obtidas 5/12 (41,6%) e 4/5 (80%) estirpes positivas para Arcobacter butzleri, provenientes, respectivamente, dos cortes de suínos e aves. Considera-se relevante a detecção do agente nos produtos de origem animal, uma vez que se trata de um patógeno emergente e com caráter zoonótico [14]. Os genes de virulência pldA, cadF, ciaB e cj 1349, estiveram presentes em 100% dos isolados de origem suína e aviária. Apesar da virulência de Arcobacter spp. ser pouco elucidada, a sua capacidade de adesão e invasão são consideradas fundamentais na patogenicidade do agente [15]. Estudos [16] levantam a hipótese da ação hemolítica do agente no organismo, intensificada pela presença do gene estrutural pldA codificador da membrana de fosfolipase A. Os genes pesquisados neste estudo estão associados aos fatores encontrados em estirpes provenientes de humanos de diversas origens do mundo, como é destacado no trabalho realizado por [17], que descreve a presença de Arcobacter butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowi em alimentos de origem animal do Sul do Iran e seis (6) fatores de virulência que conferem importância zoonótica ao patógeno. A pesquisa dos fatores de virulência encontra-se em fase de execução e novos genes devem ser pesquisados na continuidade do projeto.

Conclusão: A confirmação da presença de Arcobacter butzleri na fase final de comercialização de carnes de frangos e suínos em açougues no município de São Paulo, Brasil representa relevante risco a população. A falta de inocuidade de alimentos cárneos é motivo de preocupação, pois apesar de Arcobacter ser facilmente eliminado em temperatura de 55°C, existe o risco de contaminação cruzada com utensílios e outros produtos alimentares não cozidos. Os resultados preliminares do presente trabalho revelam a presença de estirpes com potencial patogênico conforme os fatores de virulência pesquisados. No Brasil, os isolamentos de Arcobacter em amostras de carcaça de frangos têm sido realizados apenas por grupos de pesquisa da região Sul do país, o que reforça a importância de novos estudos em outros estados brasileiros, com a finalidade de complementar as evidencias obtidas nesta pesquisa.