O envolvimento do c-terminus da proteína S100A9 na angiogênese, formação de tubos e progressão tumoral

Abstract

Introdução: Foi demonstrado que tanto a proteína S100A9 inteira, quanto o peptídeo sintético idêntico à porção C-terminal dessa proteína murina (pS100A9m) induzem efeito antinociceptivo em modelos de dor inflamatória [1]. Ainda, o pS100A9m inibe as funções de células peritoneais aderentes de camundongo [2; 3], células estas cruciais na interação entre as células tumorais e as células estromais no microambiente tumoral. O crescimento do tumor não é dependente apenas das células tumorais, mas às interações entre essas células, matriz extracelular e células do estroma, resultando em metástase [4]. Foi demonstrado que o complexo S100A8/A9 tem sido constantemente associado à malignidade [5]. Ainda, ensaios realizados in vitro demonstraram que o complexo S100A8/A9 em altas concentrações 20–250μg/ml (aproximadamente 1–10μM) exibe propriedades inibitórias sobre o crescimento de diferentes tipos de células tumorais de camundongos e humanas, além de promover a citotoxicidade e apoptose destas células [6]. Apesar dessas evidencias, até o momento ainda não foi investigado o efeito do pS100A9m sobre a progressão tumoral e angiogênese. Portanto, o objetivo do presente estudo foi a avaliação do efeito in vitro do peptídeo da S100A9m em eventos envolvidos na angiogênese e crescimento tumoral.

Material e métodos: Proliferação: 5x104 células endoteliais tímicas (tEnd.1) foram incubadas por 1h com meio RPMI ou com pS100A9m (0,585; 1,17; 2,35; 4,7 ou 9,4μM/poço). Depois, as células foram incubadas por 24h com RPMI, coradas com azul de Tripan e contadas em câmara de Neubauer. As células de tumor de Walker 256 (LLC) foram tratadas com o pS100A9m nas concentrações de 1,17; 2,35 ou 4,7μM/poço nas mesmas condições. Migração (wound healing): 1x106 células tEnd.1 foram plaqueadas em lamínulas sensibilizadas com colágeno tipo I e após sua confluência foi realizada a interrupção da monocamada celular. As células foram incubadas com RPMI ou com o pS100A9m nas mesmas concentrações mencionadas acima por 1h. Em seguida, incubadas apenas com RPMI 1% por 24h. Células migradas para o espaço vazio foram contadas em microscopia de luz. Adesão: Placas sensibilizadas com fibronectina-3μg/ poço, colágeno tipo I-10μg/poço ou laminina-10μg/poço foram incubadas por 1h com BSA 1%. Células tEnd.1 (1x105), pré-tratadas ou não por 1h com pS100A9m (0,585; 1,17; 2,35 ou 4,7μM/poço), foram aderidas por 1h às placas. Depois, foram incubadas com MTT por 3h e com SDS por 18h e a adesão avaliada por ELISA. Formação de tubos: Placas polimerizadas com Matrigel foram incubadas por até 6h com 2,5x104 células tEnd.1, pré-tratadas ou não por 1h com o pS100A9m (2,35 ou 4,7μM/poço). Em outro experimento, o pS100A9m permaneceu no ensaio por todo o período da formação dos tubos. As formações tubulares foram fotografadas em microscopia de luz e contadas.

Resultados: Ensaio de proliferação: As concentrações de 0,585; 1,17; 2,35 ou 4,7μM/poço do pS100A9m foram capazes de inibir a proliferação de tEnd.1, quando comparadas ao grupo controle. Suas porcentagens de inibição foram 51%, 36%, 56% e 43%, respectivamente. Já a concentração de 9,4μM/poço do peptídeo não alterou a proliferação das células endoteliais - Figura 1. Em relação à proliferação de células LLC, o pS100A9m inibiu esse parâmetro nas concentrações de 1,17; 2,35 ou 4,7μM/poço, sendo as porcentagens de inibição 27,5%, 34% e 33%, respectivamente - Figura 2. Ensaio de wound healing: Com relação à migração das células endoteliais, conforme demonstrado na Figura 3A, foi observada uma ação inibitória do pS100A9m nas concentrações de 0,585μM/poço (25%); 1,17μM/poço (23%); 2,35μM/poço (37%); 4,7μM/poço (21%) ou 9,4μM/poço (28%), quando comparado com o controle. A concentração de 2,35μM/poço induziu efeito inibitório estatisticamente diferente das outras concentrações do pS100A9m avaliadas. As Figuras 3B, 3C e 3D são fotomicrografias representativas das culturas celulares utilizadas para avaliar a migração de células tEnd.1 pelo método do wound healing. A Figura 3B corresponde ao tempo 0, período em que a monocamada foi interrompida. A Figura 3C corresponde ao grupo controle, células incubadas apenas com meio de cultura, em que foi observada a migração das células endoteliais tímicas para o campo vazio 24 horas após a interrupção da monocamada. A Figura 3D representa o grupo tratado com o pS100A9m (2,35μM/poço) por 1 hora após a interrupção da monocamada. Após 24 horas deste procedimento, foi observada uma inibição da migração das células endoteliais para o campo vazio, em comparação com grupo controle (representado na figura 3C). Ensaio de adesão: Todas as concentrações do peptídeo utilizadas (0,585; 1,17; 2,35; 4,7μM/poço) diminuíram a adesividade das células tEnd.1 à fibronectina e ao colágeno tipo I. Além disso, baseado nos resultados obtidos até o momento, para a adesão das tEnd.1 à laminina foi avaliada apenas a concentração de 2,35μM/poço do pS100A9m, o qual induziu uma inibição de 22% deste parâmetro em comparação com o grupo controle (dados não mostrados). Ensaio de formação de tubos: O pré-tratamento das células endoteliais tímicas com o pS100A9m, nas duas concentrações utilizadas, inibiu a formação de tubos observada em Matrigel quando comparado com o grupo controle, células tEnd.1 tratadas apenas com meio de cultura - Figura 4A. Este resultado também foi observado quando o peptídeo foi incubado concomitante às células tEnd.1 durante a formação de tubos em Matrigel - Figura 4B. As Figuras 4C e 4D são fotomicrografias representativas dos vasos formados em estrutura 3D. A Figura 4C representa o grupo controle, tratado apenas com meio de cultura, em que é observado um grande número de formações tubulares. Figura 4D representa o grupo em que as tEnd.1 foram pré-tratadas com o pS100A9m (2,35μM/poço), demonstrando uma redução das estruturas tubulares.

Conclusão: Os resultados aqui apresentados, referentes aos estudos com as células endoteliais tímicas (tEnd.1), demonstraram que o pS100A9m inibe os eventos in vitro envolvidos na angiogênese, tais como proliferação, migração e adesão à componentes de matriz extracelular, bem como a formação de novos vasos em modelo 3D de Matrigel. Esses resultados sugerem que além de inibir as funções de células inflamatórias, o peptídeo do C-terminal da S100A9 murina tem a capacidade de modular a neovascularização, a qual é fundamental para o crescimento do tumor e metástase. Ainda, o estudo preliminar sobre o efeito do pS100A9m nas células tumorais da linhagem LLC Walker 256 mostrou uma inibição da proliferação celular, sugerindo que o peptídeo também é capaz de interferir com a progressão tumoral. Em conjunto, os dados obtidos até o momento evidenciam, pela primeira vez, que o pS100A9m é um importante instrumento para a compreensão e controle da fisiopatologia do processo tumoral.