Papel da insulina na vigência do remodelamento da asma em camundongos diabéticos e sadios

Abstract

Introdução: A asma, doença inflamatória crônica das vias aéreas, envolve a participação de várias células, citocinas e mediadores inflamatórios em que a fase inicial é completamente diferente da fase tardia. Esta associada com linfócito Th2 e secreção de IgE [1,2,3]. Diabetes mellitus (DM) tipo 1 é considerada uma doença autoimune que resulta na destruição das células beta pancreáticas [4,5]. A asma e o diabetes são doenças comuns. Dados sugerem que a resposta imune é prejudicada em indivíduos diabéticos [6]. No entanto, existe uma correlação negativa entre asma e DM. A coexistência das duas patologias em um mesmo indivíduo é incomum, fato não esperado levando-se em conta a alta incidência das doenças isoladas na população geral [6,7]. Aspectos diversos desta associação já foram descritos: o desencadeamento de DM, em pacientes previamente asmáticos, determina uma melhora do quadro asmático; o tratamento de paciente diabético com insulina agrava a asma; na maioria dos casos em que ocorre a associação, a gravidade das duas doenças é leve. Em suma, asma e diabetes parecem apresentar certo tipo de antagonismo [8,9]. Estudos, utilizando modelo de inflamação pulmonar na fase inicial, revelaram que a insulina modula a produção/liberação de citocinas como TNF-α e IL-1β, além de expressão de P e E-selectina, e também a migração de neutrófilos no pulmão durante a fase inicial da reação inflamatória alérgica [10]. Portanto o presente trabalho foi delineado para avaliar o papel da insulina na vigência da fase tardia da inflamação alérgica pulmonar em camundongos diabéticos e sadios.

Material e métodos: Foram utilizados camundongos machos BALB/C (CEUA/FCF/340), (8-12 semanas). Para indução de DM os animais receberam injeção endovenosa de aloxana (50mg/kg), já os animais controle receberam a injeção de solução salina pela mesma via. Para indução de asma, os animais foram sensibilizados, dez dias após a injeção de aloxana ou salina com uma injeção intraperitoneal de ovalbumina (OVA) e hidróxido de alúmen (OVA 20μg + 2mg de Al(OH)3, volume final de 0,2 mL em PBS) e receberam uma dose reforço após 12 dias. A partir do 28º dia, os animais receberam desafios consecutivos durante sete dias. Inicialmente foi realizada uma cinética para avaliar em diferentes intervalos de tempo (1h, 2h, 3h, 6h, 8h e 12h) a redução da glicemia após o tratamento com a insulina NPH. A partir da cinética, o tratamento com insulina seguiu dois protocolos diferentes: 1) insulina (2 UI, s.c.) oito horas antes do experimento ou 2) insulina 12 horas (2 UI, s.c., as 19h) e uma hora (1 UI s.c., as 7h) antes de cada desafio. Após 24h do último desafio, ou seja, no 36º dia, foram realizadas: a) contagem total e diferencial de células no lavado broncoalveolar (LBA); b) contagem total e diferencial de células do sangue periférico, c) análise morfológica do parênquima pulmonar (H/E), d) análise da deposição em vias aéreas de colágeno, por Tricômico de Masson e, e) análise da deposição de muco no interior dos bronquiolos por periódico de Schiff (PAS).

Resultados: No presente trabalho, os experimentos realizados com camundongos machos da linhagem BALB/C, foi observado que a administração endovenosa de aloxana (60mg/kg), após dez dias e 36 dias, exibiu características do estado insulinopênico: perda de peso corporal e concentrações plasmáticas elevadas de glicose (>300 mg/dL). No mesmo período, o grupo controle apresentou normoglicemia (100-170 mg/dL), bem como ganho de peso corporal (Figura1). Na contagem total e diferencial de LBA. O grupo OVA+OVA exibiu um aumento de números de leucócitos comparado ao grupo OVA+SAL. Os grupos OVA+OVA e OVA+OVA+INS1 apresentaram cerca de 25% de eosinófilos. O grupo ALO+SAL apresentou uma diminuição de leucócitos quando comparado com o grupo OVA+SAL. O grupo ALO+OVA+INS1 apresentou um aumento de número de leucócitos quando comparado ao grupo ALO+OVA. O grupo ALO+OVA+INS14 apresentou cerca de 7% de eosinófilos presentes no LBA (Figura 2A). Já no leucograma, aparentemente o número total de células foi similar em todos os grupos, mas o grupo OVA+OVA apresentou aproximadamente 34% de eosinófilos e o grupo ALO+OVA+INS1 apresentou cerca de 10% de eosinófilos sugerindo a migração desses eosinófilos para o tecido (Figura 2B). Na morfologia, com coloração de H/E os grupos OVA+SAL, ALO+SAL, ALO+OVA e ALO+OVA+INS1 não exibiram inflamação ou anormalidades estruturais no pulmão. Já o grupo ALO+OVA+INS1, com uma única dose de insulina NPH, apresentou presença de leucócitos polimorfonucleares dentro dos vasos, corroborando com os resultados do leucograma, mostrando que as células tendem a migram para o tecido. Os grupos ALO+OVA+INS14, exibiram leucócitos polimorfonucleares no tecido, corroborando com os resultados de LBA (Figura 3). Na deposição de colágeno, foi constatado que uma única dose de insulina não foi capaz de restaurar os níveis de deposição de colágeno. Já 14 doses consecutivas, foram capazes de restaurar essa deposição de colágeno ao redor das vias aéreas (Figura4A). Na produção de muco também foi observado que uma única dose de insulina não foi capaz de restaurar a produção de muco, mas 14 doses consecutivas foram capazes de restaurar essa deposição de muco dentro das vias aéreas (Figura 4B). Os animais receberam tratamento com aloxana ou OVA, como descrito acima. Os animais diabéticos receberam 2UI de insulina NPH, e os animais asmáticos receberam 1UI de insulina NPH. Amostras de sangue foram obtidas por um corte na extremidade da cauda do animal, e a glicose determinada com um glicosímetro (Accu-Check Active – Roche Diagnosis®).

Conclusão: Os dados apresentados sugerem que a insulina modula a migração de eosinófilos no sangue periférico para o tecido pulmonar, bem como a deposição de colágeno e produção de muco durante a fase tardia da reação inflamatória alérgica.