Análise de culturas de macrófagos infectados com Encephalitozoon cuniculli após tratamento com altas diluições de phosphorus in vitro

Abstract

Encephalitozoon cuniculi (E. cuniculi) é um fungo que age como parasita intracelular e infecta diferentes tipos de células. No coelho e em animais de outras espécies imunossuprimidas, incluindo seres humanos, ele parasita tecidos neurais e causa uma síndrome neurológica muito característica (RODRÍGUEZ-TOVAR et al., 2017), cuja repertorização leva ao Phosphorus. O sucesso de sete casos clínicos de coelhos infectados naturalmente após o tratamento com Phosphorus confirmou que este medicamento é provavelmente o “gênio medicamentoso” da microsporidiose causada por esse fungo. Neste estudo, foi utilizado um modelo in vitro para colocar em evidência a relação intracelular entre macrófagos e. cuniculi após o tratamento das coculturas com diferentes potências de Phosphorus. Macrófagos RAW 264.7 foram cultivados com E cuniculi e tratados com Phosphorus 6cH, 30cH e 200cH. Os controles foram culturas não tratadas e culturas tratadas com o veículo (30% de álcool dinamizado 1:100 em água, sendo a 0,06% a concentração final de álcool). A fagocitose e a atividade do lisossoma foram avaliadas após 1 e 24 horas da incubação, com o emprego dos métodos de coloração calcofluor e alaranjado de acridina, seguidos de análise automatizada de imagens (Metamorph®). A produção de citocinas foi avaliada com o emprego do sistema MAGPIX-Luminex. Os experimentos foram realizados em triplicata. O próprio veículo pode aumentar a produção de IL6, TNF-α e MCP1 (p<0,04), reduzindo o número de fungos fagocitados (p<0,001). Um aumento transitório de RANTES (fator quimiotático para monócitos) foi visto após uma hora do tratamento com Phosphorus 200cH, seguido por aumento da atividade lisossomal, após 1 e 24 horas do tratamento (p<0,002). As características ultraestruturais dos fungos interiorizados após tratamento com Phosphorus 200cH concordam com os resultados observados na microscopia de fluorescência. Phosphorus 200cH apresentou o efeito mais evidente e específico sobre a atividade macrofágica, principalmente após 24 horas da infecção com E. cuniculi. O aumento da atividade lisossomal sugere a existência de um aumento da capacidade de digestão do parasita in vivo após um aumento transitório na produção de RANTES, que foi confirmado com a microscopia eletrônica de transmissão. O aumento transitório de RANTES pode ser fruto da monocultura: como não há linfócitos nem células NK in vitro, não há retroalimentação para que se continue a produção de RANTES. Além disso, a própria digestão dos micro-organismos limita a ativação macrofágica. O controle de qualidade de medicamentos, avaliado pelo MEV+EDS, não indicou presença de um contaminante em quantidade relevante para justificar algum efeito inespecífico do Phosphorus 200cH (CRAWFORD et al., 2011). RANTES (CCL5) é uma quimiocina expressada por muitos tipos de células hematopoiéticas e não-hematopoiéticas que desempenham papel importante na orientação e migração de células efetoras e células de memória T durante infecções agudas. Não por acaso, o receptor RANTES, CCR5, é um grande alvo de medicamentos anti-HIV, com base em bloqueio de entrada viral nas células-alvo. No entanto, os defeitos na RANTES ou receptores de RANTES CCR5 podem comprometer a imunidade para infecções agudas em modelos animais e levar à doença mais grave em seres humanos infectados com vírus do Oeste do Nilo (WNV). Em contraste, o papel da via RANTES na regulação de respostas de células T durante a infecção crônica permanece obscuro.