Diferenciação molecular de espécies de leishmania: resultados preliminares

Abstract

Mais de vinte espécies de Leishmania causam amplo espectro de manifestações clínicas em animais e humanos, sendo genericamente classificadas em leishmaniose cutânea (LC), mucocutânea (LMC) e visceral (LV), todas com ocorrência no Brasil. O diagnóstico dessa zoonose é estabelecido por avaliação clínica, sorológica e parasitológica (visualização de formas amastigotas), seguida ou não do isolamento em meio de cultura e, mais recentemente, por técnicas moleculares. Atualmente o “padrão ouro” para diferenciação das espécies de Leishmania spp. é a eletroforese de isoenzimas (multilocus enzyme electrophoresis – MLEE), técnica laboriosa, de aplicação restrita a amostras cultivadas e realizada em laboratórios de referência. Entretanto, como as técnicas baseadas na reação em cadeia pela polimerase (PCR) têm sido amplamente aplicadas para a caracterização e diferenciação das espécies de Leishmania, elas passaram a ser um importante recurso para estudos epidemiológicos e para a priorização de medidas de controle dessa zoonose. Este trabalho propõe a validação, por PCR em Tempo Real (qPCR), de oligonucleotídeos iniciadores (primers) previamente validados in silico por PCR eletrônico. Adicionalmente, alguns dos primers já validados e descritos como espécie-específicos também foram incluídos nesta validação por qPCR. Os primers foram testados em estirpes de referência de Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. infantum e L. major, cedidas pela coleção de Leishmania, do Instituto Oswaldo Cruz, e de L. chagasi, estirpe isolada localmente e cedida pelo Laboratório de Imunologia da FMVA da Unesp. De 186 pares de primers validados in silico, foram inicialmente escolhidos e testados cinco pares para cada espécie: um para L. amazonensis; um para L. infantum; dois para L. braziliensis; e dois para L. major. Os resultados obtidos confirmam a especificidade do par de primers para L. amazonensis. Os demais pares não apresentaram resultados satisfatórios, tanto relacionados à não amplificação de fragmento de DNA, como à inespecificidade. Tais fatos podem estar relacionados a fatores como: variação entre as estirpes, formação de dímeros, presença de regiões repetitivas do genoma, dentre outros, uma vez que a análise in silico realizou seleção randômica e ampla para potenciais primers num conjunto de dados específico. Outros primers deverão ser testados até que se obtenha um conjunto de pares espécie-específicos adequado para a composição de uma plataforma que permita estabelecer o diagnóstico diferencial das leishmanioses.